中國藥典2020版四部通則1021

細菌DNA特征序列鑒定法

　　細菌DNA特征序列鑒定法系以特征核酸序列作為目標檢測物，用于藥用原料、輔料、制藥用水、中間產品、終產品、包裝材料和環境等藥品全生命周期質量控制中細菌的鑒定。

　　本法通過對細菌16S核糖體RNA(16S  ribosomal  RNA gene，16S  rRNA)基因特征序列的測定，實現細菌的生物學鑒定。細菌16S rRNA基因全長約1500bp，包含9個可變區(VarIable  region，V區)和10個恒定區(Constant  region，C區)，在結構與功能上具有高度保守性，是細菌分類和鑒定中得到廣泛應用的DNA特征序列之一。

　　實驗環境和儀器的一般要求

　　開展細菌鑒定試驗的環境應具備分子生物學實驗室的基本條件，并符合相應級別的生物安全要求。

　　所用儀器有電子天平、離心機、冰箱、恒溫儀、DNA定量儀器(如紫外或熒光分光光度儀)，聚合酶鏈式反應(polymerase  chain  reaction，PCR)分析儀、電泳儀、凝膠成像儀、核酸測序儀等。

　　試劑及其制備方法

　　三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸二鈉緩沖液(TE緩沖液，pH8.0)  稱取三羥甲基氨基甲烷12.1g，加適量水攪拌溶解，并稀釋至100ml，用鹽酸試液調節pH值至8.0，得到1mol/L貯備液；稱取乙二胺四乙酸二鈉18.6g，加適量水攪拌溶解，并稀釋至100ml，用氫氧化鈉試液調節pH值至8.0，得到0.5mol/L貯備液。取三羥甲基氨基甲烷貯備液10ml，乙二胺四乙酸二鈉貯備液2ml，加水稀釋至1000ml，滅菌。

　　PCR反應緩沖液(pH8.3)  稱取三羥甲基氨基甲烷12.1g，氯化鉀37.3g，氯化鎂2.4g，加適量水攪拌溶解，并稀釋至1000ml，用鹽酸試液調節pH值至8.3，滅菌。

　　電泳緩沖液(TAE緩沖液，pH8.0)  稱取三羥甲基氨基甲烷4.84g，冰乙酸1.14ml，乙二胺四乙酸二鈉0.75g，加適量水攪拌溶解，并稀釋至1000ml，用氫氧化鈉試液調節pH值至8.0。

　　上樣緩沖液  稱取溴溴酚藍0.25g，二甲苯氰0.25g，蔗糖40.0g，加適量水攪拌溶解，并稀釋至100ml。

　　核酸的提取、擴增、產物檢測和純化等也可以采用適宜的商品化試劑和試劑盒。

　　方法適用性試驗

　　細菌DNA特征序列鑒定時，應進行方法適用性試驗，以確認所采用的方法適合于目標菌的鑒定。若鑒定條件發生變化可能影響鑒定結果時，應重新進行方法適用性試驗。

　　進行方法適用性試驗時，選擇革蘭陽性和陰性標準菌株按“待檢菌的測定”步驟進行操作。提取的核酸質量應能滿足核酸擴增的要求；核酸擴增產物應能在500bp左右檢測到一條目的條帶；核酸測序結果應與相應對照菌株的核酸序列一致。

　　方法適用性試驗應設定陰性對照試驗，取滅菌的純化水作為陰性對照，照核酸提取及后續步驟進行操作。核酸擴增產物應無擴增條帶。

　　方法適用性試驗可與待檢菌的測定同時進行。

　　待檢菌的測定

　　待檢菌的測定應設置陽性對照試驗和陰性對照試驗。

　　陽性對照試驗

　　根據待檢菌的革蘭染色等特性，選擇特征序列確定的菌株作為陽性對照菌，照待檢菌的測定步驟進行操作。陽性對照試驗提取的核酸質量應能滿足核酸擴增的要求；核酸擴增產物應能在500bp左右檢測到一條目的條帶；核酸測序結果應與相應對照菌株的核酸序列一致。

　　陰性對照試驗

　　取滅菌的純化水作為陰性對照，照核酸提取及后續步驟進行操作，用以確證核酸提取、PCR反應體系和擴增過程無污染。陰性對照試驗的核酸擴增產物應無擴增條帶。

　　待檢菌測定

　　(1)分離純化   挑取待檢菌在適宜的固體培養基上連續劃線培養，以獲取純培養物(單個菌落)。

　　(2)核酸提取   核酸提取常用十六烷基三甲溴化銨(cetyltrimethylammonium  bromide  method，CTAB)法，也可采用十二烷基硫酸鈉法、堿裂解法等其他適宜的方法，必要時加入核糖核酸酶(ribonuclease，RNase)去除RNA。

　　CTAB法提取核酸的一般步驟   取適量經分離純化后的

　　待測菌純培養物于離心管中，加入TE緩沖液450μl、溶菌酶(10mg/ml)25μl，混勻，置37℃水浴加熱30分鐘；加入10%十二烷基硫酸鈉溶液50μl，混勻，置37℃水浴加熱15分鐘；加入1%氯化鈉溶液80μl、10%CTAB溶液70μl，混勻，置65℃水浴加熱15分鐘；加入飽和苯酚-三氯甲烷-異戊醇(25：24：1，ml/m1)溶液350μl，劇烈振蕩，室溫靜置5分鐘，離心(轉速為每分鐘12000轉)10分鐘，取上清液置于新的離心管中，重復操作1次；加入2倍體積無水乙醇，于-20℃靜置不少于30分鐘，離心(轉速為每分鐘12000轉)10分鐘，棄去上清液；加入適量75%乙醇溶液洗滌，離心(轉速為每分鐘12000轉)10分鐘，棄去上清液，室溫風干至乙醇揮發完全；加入適宜體積的TE緩沖液溶解，作為核酸提取溶液(模板DNA)，置2～8℃冰箱中備用。

　　待檢菌提取的核酸質量應能滿足核酸擴增的要求，核酸濃度宜不低于10ng/μl。模板DNA濃度和純度測定常用紫外分光光度法，A260/A280比值宜在1.8～2.0之間。

　　(3)核酸擴增  本法中的核酸擴增是指對16S rRNA基因VI～V3可變區核酸序列片段進行擴增，其擴增引物、反應體系及擴增程序如下：

　　擴增引物  正向引物(16SV1F):5'-AGAGTTTGATC-CTGGCTCAG-3'；

　　反向引物(16SV3R)：5'-GTATTACCGCGGCTGCTGGC-3'。

　　反應體系  常用的PCR反應體系為25μl。制備時，取PCR反應緩沖液2.5μl，脫氧核糖核苷三磷酸(2.5mmol/L)2μl，正向和反向引物(2.5μmol/L)各2μl，模板DNA 1μl，Taq DNA聚合酶(1U/μl)1μl，加滅菌的純化水至25μl。

　　擴增程序  采用的擴增程序為：94℃預變性3分鐘；94℃變性30秒，55～60℃退火30秒，72℃延伸60秒，30個循環；72℃繼續延伸5分鐘。

　　(4)核酸擴増產物的檢測  采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測核酸擴增產物。使用電泳緩沖液配制1.5%瓊脂糖凝膠，其中加入溴化乙錠或吖啶橙等適宜的核酸凝膠染色劑。取核酸擴增產物5μl、上樣緩沖液1μl，混勻后上樣，于100～150V電壓下電泳，溴酚藍條帶移動至凝膠片的1/2～2/3處結束電泳。取凝膠片在紫外凝膠成像儀上檢視，核酸擴增產物應在約500bp的位置出現一條目的條帶。核酸擴增產物檢測時應選擇適宜的DNA分子量標記，目的條帶的大小應包括在DNA分子量標記的范圍內。

　　(5)核酸擴增產物的純化  核酸擴增產物應進行純化，去除擴增引物、模板DNA、Taq DNA聚合酶等殘留。核酸擴增產物純化的主要步驟包括：將瓊脂糖凝膠中的核酸擴增產物切下，置于離心管中，加入適量體積的TE緩沖液，65～95℃水浴至凝膠塊完全溶解；分別加入1/10體積乙酸鈉溶液(3mol/L，pH5.2)和乙二胺四乙酸鈉溶液(125mmol/L，pH8.0)，混勻；加入2倍體積無水乙醇，-20℃靜置30分鐘；離心(轉速為每分鐘12000轉)10分鐘，棄去上清液；加入適量75%乙醇溶液洗滌，離心(轉速為每分鐘12000轉)10分鐘，棄去上清液，室溫風干至乙醇揮發完全；加入適宜體積的TE緩沖溶液溶解，作為核酸擴增產物的純化溶液，置2～8℃冰箱中備用。

　　(6)核酸測序 以擴增引物作為測序引物，使用核酸測序儀對純化后的核酸擴增產物進行雙向測序，獲得目標核酸序列。對核酸測序結果進行序列質量核查。雙向測序峰圖應采用有峰圖拼接功能的軟件，以正、反向核酸序列疊加的方式進行序列拼接，并去除兩端引物區序列。拼接后得到的核酸序列方向應與核酸擴增正向引物方向一致。

　　(7)結果判定  將獲得的細菌DNA特征序列與經驗證過的專用數據庫進行比對。根據比對結果進行判定。