質譜法

中國藥典2020版四部-通則0431

　　質譜法是使待測化合物產生氣態離子，再按質荷比（m/z）將離子分離、檢測的分析方法，檢測限可達 10^-15~10^-12mol 數量級。質譜法可提供分子質量和結構的信息，定量測定可采用內標法或外標法。
　　質譜儀的主要組成如圖所示。在由泵維持的約 10^-3~10^-6Pa 真空狀態下，離子源產生的各種正離子（或負離子），經加速，進入質量分析器分離，再由檢測器檢測。計算機系統用于控制儀器，記錄、處理并儲存數據，當配有標準譜庫軟件時，計算機系統可以將測得的質譜與標準譜庫中圖譜比較，獲得可能化合物的組成和結構信息。
　　

　　一、進樣系統
　　樣品導入不影響質譜儀的真空度。進樣方式的選擇取決于樣品的性質、純度及所采用的離子化方式。
　　1.直接進樣
　　室溫常壓下，氣態或液態化合物的中性分子通過可控漏孔系統，進入離子源。吸附在固體上或溶解在液體中的揮發性待測化合物可采用頂空分析法提取和富集，程序升溫解吸附，再經毛細管導入質譜儀。
　　揮發性固體樣品可置于進樣桿頂端，在接近離子源的高真空狀態下加熱、氣化。采用解吸離子化技術，可以使熱不穩定的、難揮發的樣品在氣化的同時離子化。
　　多種分離技術已實現了與質譜的聯用。經分離后的各種待測成分可以通過適當的接口導入質譜儀分析。
　　2.氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）
　　在使用毛細管氣相色譜柱及高容量質譜真空泵的情況下，色譜流出物可直接引入質譜儀。
　　3.液相色譜-質譜聯用（LC-MS）
　　使待測化合物從色譜流出物中分離、形成適合于質譜分析的氣態分子或離子需要特殊的接口。為減少污染，避免化學噪聲和電離抑制，流動相中所含的緩沖鹽或添加劑通常應具有揮發性，且用量也有一定的限制。
　�。�1）粒子束接口  液相色譜的流出物在去溶劑室霧化、脫溶劑后，僅待測化合物的中性分子被引入質譜離子源。粒子束接口適用于分子質量小于 1000 道爾頓的弱極性、熱穩定化合物的分析，測得的質譜可以由電子轟擊離子化或化學離子化產生。電子轟擊離子化質譜常含有豐富的結構信息。
　�。�2）移動帶接口  流速為 0.5~l.5ml/min 的液相色譜流出物，均勻地滴加在移動帶上，蒸發、除去溶劑后，待測化合物被引入質譜離子源。移動帶接口不適宜于極性大或熱不穩定化合物的分析，測得的質譜可以由電子轟擊離子化或化學離子化或快原子轟擊離子化產生。
　�。�3）大氣壓離子化接口  是目前液相色譜-質譜聯用廣泛采用的接口技術。由于兼具離子化功能，這些接口將在離子源部分介紹。
　　4.超臨界流體色譜-質譜聯用（SFC-MS）
　　超臨界流體色譜-質譜聯用主要采用大氣壓化學離子化或電噴霧離子化接口。色譜流出物通過一個位于柱子和離子源之間的加熱限流器轉變為氣態，進入質譜儀分析。
　　5.毛細管電泳-質譜聯用（CE-MS）
　　幾乎所有的毛細管電泳操作模式均可與質譜聯用。選擇接口時，應注意毛細管電泳的低流速特點并使用揮發性緩沖液。電噴霧離子化是毛細管電泳與質譜聯用最常用的接口技術。
　　二、離子源
　　根據待測化合物的性質及擬獲取的信息類型，可以選用不同的離子源。
　　1.電子轟擊離子化（EI）
　　處于離子源的氣態待測化合物分子，受到一束能量（通常是 70eV）大于其電離能的電子轟擊而離子化。質譜中往往含有待測化合物的分子離子及具有待測化合物結構特征的碎片離子。電子轟擊離子化適用于熱穩定的、易揮發化合物的離子化，是氣相色譜-質譜聯用最常用的離子化方式。當采用粒子束或移動帶等接口時，電子轟擊離子化也可用于液相色譜-質譜聯用。
　　2.化學離子化（CI）
　　離子源中的試劑氣分子（如甲烷、異丁烷和氨氣）受高能電子轟擊而離子化，進一步發生離子-分子反應，產生穩定的試劑氣離子，再使待測化合物離子化�；瘜W離子化可產生待測化合物（M）的（M+H）+或（M-H）-特征離子或待測化合物與試劑氣分子產生的加合離子。與電子轟擊離子化質譜相比，化學離子化質譜中碎片離子較少，適宜于采用電子轟擊離子化無法得到分子質量信息的熱穩定的、易揮發化合物分析。
　　3.快原子轟擊（FAB）或快離子轟擊離子化（LSIMS）
　　高能中性原子（如氬氣）或高能銫離子，使置于金屬表面、分散于惰性黏稠基質（如甘油）中的待測化合物離子化，產生（M+H）+或（M-H）-特征離子或待測化合物與基質分子的加合離子�？煸�子轟擊或快離子轟擊離子化非常適合于各種極性的、熱不穩定化合物的分子質量測定及結構表征，廣泛應用于分子質量高達 10 000 道爾頓的肽、抗生素、核苷酸、脂質、有機金屬化合物及表面活性劑的分析。
　　快原子轟擊或快離子轟擊離子化用于液相色譜-質譜聯用時，需在色譜流動相中添加 1%~10%的甘油，且必須保持很低流速（1~10μl/min）。
　　4.基質輔助激光解吸離子化（MALDI）
　　將溶于適當基質中的供試品涂布于金屬靶上，用高強度的紫外或紅外脈沖激光照射，使待測化合物離子化�；�質輔助激光解吸離子化主要用于分子質量在 100 000 道爾頓以上的生物大分子分析，適宜與飛行時間分析器結合使用。
　　5.電噴霧離子化（ESI）
　　離子化在大氣壓下進行。待測溶液（如液相色譜流出物）通過一終端加有幾千伏高壓的毛細管進入離子源，氣體輔助霧化，產生的微小液滴去溶劑，形成單電荷或多電荷的氣態離子。這些離子再經逐步減壓區域，從大氣壓狀態傳送到質譜儀的高真空中。電噴霧離子化可在 1μl/min~1ml/min 流速下進行，適合極性化合物和分子質量高達 100 000 道爾頓的生物大分子研究，是液相色譜-質譜聯用、毛細管電泳-質譜聯用最成功的接口技術。
　　6.大氣壓化學離子化（APCI）
　　原理與化學離子化相同，但離子化在大氣壓下進行。流動相在熱及氮氣流的作用下霧化成氣態，經由帶有幾千伏高壓的放電電極時離子化，產生的試劑氣離子與待測化合物分子發生離子-分子反應，形成單電荷離子，正離子通常是（M+H）+，負離子則是（M-H）-。大氣壓化學離子化能在流速高達 2ml/min 下進行，常用于分析分子質量小于 1500 道爾頓的小分子或弱極性化合物，主要產生的是（M+H）+或（M-H）-離子，很少有碎片離子，是液相色譜-質譜聯用的重要接口之一。
　　7.大氣壓光離子化（APPI）
　　與大氣壓化學離子化不同，大氣壓光離子化是利用光子使氣相分子離子化。該離子化源主要用于非極性物質的分析，是電噴霧離子化、大氣壓化學離子化的一種補充。大氣壓光離子化對于試驗條件比較敏感，摻雜劑、溶劑及緩沖溶液的組成等均會對測定的選擇性、靈敏度產生較大影響。
　　三、質量分析器
　　質量范圍、分辨率是質量分析器的兩個主要性能指標。質量范圍指質量分析器所能測定的質荷比的范圍；分辨率表示質量分析器分辨相鄰的、質量差異很小的峰的能力。雖然不同類型的質量分析器對分辨率的具體定義存在差異，高分辨質譜儀通常指其質量分析器的分辨率大于 10⁴。
　　1.扇形磁場分析器
　　離子源中產生的離子經加速電壓（V）加速，聚焦進入扇形磁場（磁場強度 B）。在磁場的作用下，不同質荷比的離子發生偏轉，按各自的曲率半徑（r）運動：
　　m/z=B²r²/2V
　　改變磁場強度，可以使不同質荷比的離子具有相同的運動曲率半徑（r），進而通過狹縫出口，達到檢測器。
　　扇形磁場分析器可以檢測分子質量高達 15 000 道爾頓的單電荷離子。當與靜電場分析器結合、構成雙聚焦扇形磁場分析器時，分辨率可達到 10⁵。
　　2.四極桿分析器
　　分析器由四根平行排列的金屬桿狀電極組成。直流電壓（DC）和射頻電壓（RF）作用于電極上，形成了高頻振蕩電場（四極場）。在特定的直流電壓和射頻電壓條件下，一定質荷比的離子可以穩定地穿過四極場，到達檢測器。改變直流電壓和射頻電壓大小，但維持它們的比值恒定，可以實現質譜掃描。
　　四極桿分析器可檢測的分子質量上限通常是 4000 道爾頓，分辨率約為 10³。
　　3.離子阱分析器
　　四極離子阱（QIT）由兩個端蓋電極和位于它們之間的環電極組成。端蓋電極處在地電位，而環電極上施加射頻電壓（RF），以形成三維四極場。選擇適當的射頻電壓，四極場可以儲存質荷比大于某特定值的所有離子。采用“質量選擇不穩定性”模式，提高射頻電壓值，可以將離子按質量從高到低依次射出離子阱。揮發性待測化合物的離子化和質量分析可以在同一四極場內完成。通過設定時間序列，單個四極離子阱可以實現多級質譜（MSⁿ）的功能。
　　線性離子阱（LIT）是二維四極離子阱，結構上等同于四極質量分析器，但操作模式與三維離子阱相似。四極線性離子阱具有更好的離子儲存效率和儲存容量，可改善的離子噴射效率及更快的掃描速度和較高的檢測靈敏度。
　　離子阱分析器與四極桿分析器具有相近的質量上限及分辨率。
　　4.飛行時間分析器（TOF）
　　具有相同動能、不同質量的離子，因飛行速度不同而實現分離。當飛行距離一定時，離子飛行需要的時間與質荷比的平方根成正比，質量小的離子在較短時間到達檢測器。為了測定飛行時間，將離子以不連續的組引入質量分析器，以明確起始飛行時間。離子組可以由脈沖式離子化（如基質輔助激光解吸離子化）產生，也可通過門控系統將連續產生的離子流在給定時間引入飛行管。
　　飛行時間分析器的質量分析上限約 15 000 道爾頓、離子傳輸效率高（尤其是譜圖獲取速度快）、質量分辨率＞10⁴。
　　5.離子回旋共振分析器（ICR）
　　在高真空（~10^-7Pa）狀態下，離子在超導磁場中作回旋運動，運行軌道隨著共振交變電場而改變。當交變電場的頻率和離子回旋頻率相同時，離子被穩定加速，軌道半徑越來越大，動能不斷增加。關閉交變電場，軌道上的離子在電極上產生交變的像電流。利用計算機進行傅里葉變換，將像電流信號轉換為頻譜信號，獲得質譜。
　　待測化合物的離子化和質量分析可以在同一分析器內完成。離子回旋共振分析器的質量分析上限＞10⁴ 道爾頓，分辨率高達 10⁶，質荷比測定精確到千分之一，可以進行多級質譜（MSn）分析。
　　6.串聯質譜（MS-MS）
　　串聯質譜是時間上或空間上兩級以上質量分析的結合，測定第一級質量分析器中的前體離子（precursor ion）與第二級質量分析器中的產物離子（product ion）之間的質量關系。多級質譜實驗常以 MSn 表示。
　　產物離子掃描（product-ion scan）  在第一級質量分析器中選擇某m/z的離子作為前體離子，測定該離子在第二級質量分析器中、一定的質量范圍內的所有碎片離子（產物離子）的質荷比與相對強度，獲得該前體離子的質譜。
　　前體離子掃描（precursor-ion scan）  在第二級質量分析器中選擇某 m/z 的產物離子，測定在第一級質量分析器中、一定的質量范圍內所有能產生該碎片離子的前體離子。
　　中性丟失掃描（neutral-loss scan）  以恒定的質量差異，在一定的質量范圍內同時測定第一級、第二級質量分析器中的所有前體離子和產物離子，以發現能產生特定中性碎片（如CO2）丟失的化合物或同系物。
　　選擇反應檢測（selected-reaction monitoring，SRM）  選擇第一級質量分析器中某前體離子（m/z）₁，測定該離子在第二級質量分析器中的特定產物離子（m/z）₂ 的強度，以定量分析復雜混合物中的低濃度待測化合物。
　　多反應檢測（multiple-reaction monitoring，MRM）  是指同時檢測兩對及以上的前體離子-產物離子。
　　四、測定法
　　在進行供試品分析前，應對測定用單級質譜儀或串聯質譜儀進行質量校正�？刹捎脜⒈任镔|單獨校正或與被測物混合測定校正的方式。
　　1.定性分析
　　以質荷比為橫坐標，以離子的相對豐度為縱坐標，測定物質的質譜。高分辨質譜儀可以測定物質的準確分子質量。
　　在相同的儀器及分析條件下，直接進樣或流動注射進樣，分別測定對照品和供試品的質譜，觀察特定 m/z 處離子的存在，可以鑒別藥物、雜質或非法添加物。產物離子掃描可以用于極性的大分子化合物的鑒別。復雜供試品中待測成分的鑒定，應采用色譜-質譜聯用儀或串聯質譜儀。
　　質譜中不同質荷比離子的存在及其強度信息反映了待測化合物的結構特征，結合串聯質譜分析結果，可以推測或確證待測化合物的分子結構。當采用電子轟擊離子化時，可以通過比對待測化合物的質譜與標準譜庫譜圖的一致性，快速鑒定化合物。未知化合物的結構解析，常常需要綜合應用各種質譜技術并結合供試品的來源，必要時還應結合元素分析、光譜分析（如核磁共振、紅外光譜、紫外光譜、X 射線衍射）的結果綜合判斷。
　　2.定量分析
　　采用選擇離子檢測（selected-ion monitoring，SIM）或選擇反應檢測或多反應檢測，外標法或內標法定量。內標化合物可以是待測化合物的結構類似物或其穩定同位素（如 ²H，¹³C，¹⁵N）標記物。
　　分別配制一定濃度的供試品及雜質對照品溶液，色譜-質譜分析。若供試品溶液在特征 m/z 離子處的響應值（或響應值之和）小于雜質對照品溶液在相同特征 m/z 離子處的響應值（或響應值之和），則供試品所含雜質符合要求。
　　復雜樣本中的有毒有害物質、非法添加物、微量藥物及其代謝物的色譜-質譜分析，宜釆用標準曲線法。通過測定相同體積的系列標準溶液在特征 m/z 離子處的響應值，獲得標準曲線及回歸方程。按規定制備供試品溶液，測定其在特征 m/z 離子處的響應值，帶入標準曲線或回歸方程計算，得到待測物的濃度。內標校正的標準曲線法是將等量的內標加入系列標準溶液中，測定待測物與內標物在各自特征 m/z 離子處的響應值，以響應值的比值為縱坐標，待測物濃度為橫坐標繪制標準曲線，計算回歸方程。使用穩定同位素標記物作為內標時，可以獲得更好的分析精密度和準確度。