生物制品生物活性/效價測定方法驗證指導原則

中國藥典2020版三部三部通則9401

        對藥品質量控制分析方法進行驗證的目的是證明采用的方法適合于相應檢測要求。生物制品質量控制中生物活性/效價為反映生物制品有效性的關鍵質量屬性，對相應的測定方法進行規范的驗證是保障其適用性的前提。本指導原則從驗證方案的制訂、各驗證指標的具體驗證策略、驗證結果的記錄和方法的監控及再驗證的角度闡述了生物活性/效價測定方法驗證相關的要求，旨在對新建的或擬修訂的生物制品生物活性/效價測定方法所開展的驗證工作進行規范與指導。本指導原則中的生物活性/效價測定主要是指相對效價測定，該法系將供試品的生物反應與已知標準品產生的反應相比較，從而定量測定供試品相對于標準品的效價。
　　一、方法驗證的基本要素
　�。ㄒ唬�驗證方案
　　方法驗證需根據驗證方案來完成。驗證方案不僅應包括驗證設計、驗證指標、合理的可接受標準和數據分析計劃，還應涵蓋不符合可接受標準時可采取的措施等。
　　1. 驗證設計
　　驗證設計主要涉及樣品的選擇、實驗變異來源的考量及試驗重復策略等。應采用具有代表性的樣品進行驗證試驗，并在驗證方案中注明所需樣品的類型及數量。實驗變異的來源主要包括樣品的制備、試驗內和試驗間的影響因素。試驗內變異可能受方法開發階段所確定的實驗條件（溫度、pH、孵育時間等）、實驗設計（動物數量、稀釋度組數、每個稀釋組的重復數、稀釋度間隔等）、試驗過程、系統適用性和樣品適用性要求、統計分析等因素的影響。而試驗間變異主要受不同分析人員、不同試驗時間、不同儀器設備和試劑批次等因素的影響。因此，一個設計良好的驗證方案應綜合考量試驗內和試驗間變異的來源。此外，每輪驗證試驗中標準品和供試品均應獨立制備。驗證中使用的重復策略應盡量反映影響效價測定結果的實驗因素。
　　2. 驗證指標與可接受標準
　　由于相對效價測定方法各具特點，并隨分析對象而變化，因此需視具體方法擬訂具體的驗證指標，關于常見驗證指標的具體討論見本指導原則“（二）各驗證指標的驗證策略”項下。應根據測定方法特點和驗證目的來確定各驗證指標的可接受標準。在評估某些驗證指標是否符合可接受標準時，除了判定驗證結果是否符合預設標準外，還可通過等效性檢驗方法判定驗證結果的置信區間是否也符合要求。同時還應分別建立試驗有效性的可接受標準（系統適用性要求）和樣品結果有效性的可接受標準（樣品適用性要求），上述標準可根據方法開發的情況制定，但最終需根據驗證的數據進行修正并在驗證完成前確定。
　　3. 數據分析計劃
　　應按照驗證方案中列出的數據分析計劃對驗證結果進行分析，包括對驗證指標結果的繪圖和統計學分析，以及判斷它們是否符合可接受標準等。常規的統計學方法一般要求數據之間相互獨立，并呈近似正態分布和方差齊性。而測得的相對效價在多數情況下服從近似對數正態分布，因此，為滿足上述統計學要求，通常采用相對效價的對數轉換值進行數據分析，本指導原則中對數轉換的底數可取任一適用的底數，一般以無理數e或10為底。當無法滿足上述統計學要求時，也可考慮釆用其他適宜的替代方法進行數據分析�？稍跍y定方法開發階段通過對適量歷史數據的分析而獲知測得的相對效價的分布情況，若確定測得的相對效價為正態分布，則可直接釆用測得值按下述統計方法進行數據處理，此時精密度一般用標準偏差（SD）或相對標準偏差（RSD，%）表示。
　�。ǘ�）各驗證指標的驗證策略
　　常見的驗證指標包括專屬性、相對準確度、精密度、線性和范圍，后4個指標的驗證通�？蛇M行合并設計。
　　1. 專屬性
　�。�1）定義   專屬性系指在其他成分，如雜質、降解產物、基質等存在時，采用的測定方法不受這些成分的干擾能正確測定待測物的能力。專屬性亦可指測定方法區分相關物質的能力，因此，對待測物中任何已存在的或新引入的相關物質均應加以研究。如方法專屬性不強，應采用多種不同原理的方法予以補充。
　�。�2）評價方法   在雜質、降解產物或基質可獲得的情況下，往平行稀釋的標準品溶液中加入潛在的干擾物，并與未加干擾物的標準品溶液比較測得的相對效價的結果，采用合適的等效性檢驗方法考察二者劑量-反應曲線的相似性和效價測得結果的一致性。也可取基質或與待測物結構相似的產品相關產物或非相關物質進行試驗，基質、產品相關產物或非相關物質應均呈陰性反應。
　　在雜質、降解產物或基質不能獲得的情況下，也可用強光照射、高溫、高濕等方式對供試品進行加速破壞，以研究可能存在的降解產物和降解途徑對相對效價測定的影響。
　　2. 相對準確度
　�。�1）定義  系指在規定的范圍內，測得的相對效價與真實值或參考值接近的程度，一般用相對偏倚（RB，%）或其他適宜指標表示。
　�。�2）評價方法  在規定范圍內，取標準品或已知效價的供試品稀釋至不同的目標效價水平，一般至少需要評估3個效價水平，但為了獲得更可靠的結果，推薦評估5個效價水平，每個效價水平分別至少獨立測定3次。以效價理論值的對數（橫坐標）對其相應的效價測定值的對數（縱坐標）作直線回歸。采用每個效價水平測定值的相對偏倚和不同效價水平相對偏倚的變化趨勢或其他適宜指標來評價相對準確度，其中相對偏倚的變化趨勢可用直線回歸方程的斜率進行評價。
　　相對偏倚計算公式如下：
　　

　　在每個效價水平上，測得的相對效價的對數平均值的
　　100（1-2α）％（通常取α=0.05，即90%）置信區間（CI )
　　可按下式計算:
　　

　　式中    Average為每個效價水平效價測定值的對數平均值；
　　SD為每個效價水平效價測定值的對數標準偏差；
　　n為每個效價水平效價測定值的個數；
　　tdf為自由度為df時的t界值表查表值；
　　df為自由度，等于每個效價水平測定值個數減1。
　　再按下式計算每個效價水平上相對偏倚的100（1-2α）％（通常取α=0.05，即90%）置信區間（CIRB）。
　　

　　式中    LCI為每個效價水平效價測定值的對數平均值的90%置信下限；
　　UCI為每個效價水平效價測定值的對數平均值的90%置信上限。
　�。�3）數據要求  應報告每個效價水平效價測定值的相對偏倚、直線回歸方程的斜率或其他適宜的評價指標，上述指標均應符合驗證方案中預先設定的可接受標準。必要時還應報告相對偏倚或其他適宜指標的置信區間。
　　3. 精密度
　�。�1）定義  精密度系指在規定的條件下，同一份均勻供試品，經多次取樣測定所得結果之間的接近程度，包括重復性、中間精密度和重現性。由于相對效價測定方法的中間精密度包含重復性考察，因此，本指導原則中主要介紹中間精密度的評價方法，必要時還應進行不同實驗室間的重現性考察。相對效價測定方法的精密度一般用幾何標準偏差（GSD）或幾何變異系數（GCV，%）表示，可采用下述方法或方差分析法（ANONA）進行評價。
　�。�2）評價方法  在規定范圍內，考察隨機變動因素如不同日期、不同分析人員、不同儀器、不同關鍵試劑批次等對精密度的影響，實驗設計同本指導原則“一、(二)2.相對準確度(2)評價方法”項。以每個效價水平測得的相對效價的幾何標準偏差或幾何變異系數來評價中間精密度。
　　在每個效價水平上，測得的相對效價的幾何標準偏差計算公式如下：
　　GSD=antilog(SD)
　　式中   SD為每個效價水平效價測定值的對數標準偏差。
　　在每個效價水平上，測得的相對效價的幾何變異系數計算公式如下：
　　GCV=(GSD-1)×100%
　　對于SD，僅需關注其100(1-α)%(通常取α=0.05，即95%)的置信上限(CISD)，其計算公式如下：
　　

　　(3)數據要求  應報告每個效價水平效價測定值的幾何標準偏差、幾何變異系數或相應的置信區間，幾何變異系數應符合驗證方案中預先設定的可接受標準。采用方差分析法進行評價時，還可報告各效價水平合并計算后總的幾何變異系數，并分析變異來源。
　　4. 線性
　　(1)定義  通常系指在設計的范圍內，測得的相對效價與真實值或參考值之間的線性關系，為與相對準確度相關的稀釋線性。
　　(2)評價方法  在規定范圍內，取標準品稀釋至不同的目標效價水平，通常至少制備3個效價水平的標準品溶液，但推薦評估5個效價水平。以效價理論值的對數(橫坐標)對其相應的效價測定值的對數(縱坐標)作圖，釆用最小二乘法進行線性回歸。
　　(3)數據要求  應列出線性圖、直線回歸方程、斜率、y軸截距和相關系數。相關系數應符合驗證方案中預先設定的可接受標準或直線回歸方程的顯著性檢驗應具有統計學意義。
　　5. 范圍
　　(1)定義   系指測定方法能達到一定相對準確度、中間精密度和線性要求時的高低限相對效價水平或量的區間。
　　(2)評價方法   該范圍通常來源于稀釋線性研究，評估的效價水平應至少涵蓋產品效價質量標準的范圍。對于穩定性研究或其他特殊情況，可視具體情況適當擴大方法驗證的范圍。
　　(3)數據要求   應報告相對準確度、中間精密度和線性符合要求時的相對效價水平或量的范圍。
　　6. 其他驗證指標的考慮
　　由于分析方法驗證指導原則(指導原則9101)介紹的其他驗證指標如檢測限和定量限與報告相對效價的生物檢定方法無關，因此，上述指標在本指導原則均未涉及。此外，耐用性也未列入本指導原則的驗證要求中，建議在測定方法開發階段或預驗證階段進行該指標的考察，以確定測定方法的重要實驗參數及相應的范圍，并建立一系列的系統適用性要求。但對于一些關鍵因素如孵育時間、孵育溫度、細胞代次和細胞數量等在驗證時仍需進一步開展耐用性研究，尤其是當這些因素與驗證中引入的其他因素有相互作用時。
　　(三) 驗證結果的記錄
　　驗證結果應記錄在驗證報告中。驗證報告可包含原始數據和中間結果，一般應報告每個效價水平驗證指標的測定值或各效價水平合并計算后的總體測定值。預驗證的實驗結果也可納入驗證報告中，這將有助于確定測定方法的最終實驗條件。若驗證結果均符合可接受標準，即可得岀測定方法適用于其檢測目的的結論；反之，當驗證結果與驗證方案規定的可接受標準有偏差時，應對驗證失敗的原因進行分析，并提出失敗后的糾正措施，如優化方法的實驗條件、修改方法的重復策略或視情況修正可接受標準等。
　　(四) 方法的監控及再驗證
　　相對效價測定方法經過驗證后即可開始使用，但仍需對其性能進行持續的監控。最簡單的監控方法即是對適宜的參數釆用統計過程控制(SPC)圖進行持續監控，如標準品的劑量-反應曲線和質控品的效價測定值等。這些SPC圖可用于識別相對效價測定方法早期的波動或漂移，若在SPC圖中觀察到任何變化趨勢，即應對產生該趨勢變化的原因進行調查。
　　由于藥品生產工藝變更、制劑的組分變更或其他原因需對測定方法進行較大改動時，應根據方法修訂的程度確定再驗證的范圍。相對效價測定方法的再驗證包括重新執行一次完整的驗證或通過橋接實驗來將原始測定方法過渡到修訂方法。
　　二、 方法驗證實例
　　以下分別列舉了一個基于細胞的體外生物學活性測定法和基于動物的體內生物學活性測定法的驗證實例，以闡述不同生物活性測定方法的驗證過程。需要說明的是，以下實例僅作為演示分析步驟和計算過程用，不同的測定方法可根據其具體特點選擇與實例中不同的實驗設計和制定不同的可接受標準。
　�。ㄒ唬�體外生物學活性測定法
　　1. 實驗設計及測定結果
　　以人粒細胞刺激因子生物學活性測定法（NFS-60細胞/MTT比色法）（通則3525）的驗證為例，考察測定方法的相對準確度、中間精密度、線性和范圍，4項指標的驗證采用合并設計。取重組人粒細胞刺激因子（GCSF）工作標準品，按說明書復溶后，用基礎培養液稀釋至每lml中分別含200IU的標準品溶液及128IU、160IU、200IU、250IU和312IU的待測溶液，然后取標準品溶液和待測溶液在96孔細胞培養板中，做2倍系列稀釋，共8個稀釋度，每個稀釋度做2孔，按通則3525進行試驗。即5個待測溶液的相對效價水平分別為64%、80%、100%、125%和156%，在對數尺度上呈均勻間隔。每個效價水平由兩名分析人員在不同日期使用4個細胞代次進行相對效價測定，每次試驗每個效價水平每名分析人員采用每個細胞代次獨立測定兩份，每次以兩份結果的幾何均值作為報告值。測定結果見表1。
　　

　　2. 可接受標準及驗證結果
　�。�1）相對準確度
　�、倏山邮軜藴�  每個效價水平相對效價測定值的相對偏倚應在±12%范圍內；以效價理論值的對數（橫坐標）對其相應的效價測定值的對數（縱坐標）作直線回歸，回歸方程的斜率應在0.80～1.25范圍內。
　�、隍炞C結果  按“（二）各驗證指標的驗證策略2. 相對準確度（2）評價方法”項下計算公式計算每個效價水平相對效價測定值的相對偏倚及其置信區間，結果見表2。相對偏倚均在±12%范圍內。以效價理論值的對數（橫坐標）對其相應的效價測定值的對數（縱坐標）作直線回歸，回歸方程為y=1.0182x+0.0385。斜率1.0182在0.8～1.25之間。
　　

　�。�2）中間精密度
　�、倏山邮軜藴�  每個效價水平相對效價測定值的幾何變異系數（GCV，%）應不大于20%。
　�、隍炞C結果按“（二）各驗證指標的驗證策略3.精密度（2）評價方法”項下計算公式計算每個效價水平相對效價測定值的幾何標準偏差、幾何變異系數及其置信上限，結果見表3。每個效價水平相對效價測定值的幾何變異系數均小于20%。
　　

　�。�3）線性
　�、倏山邮軜藴�  以效價理論值的對數（橫坐標）對其相應的效價測定值的對數（縱坐標）作圖，釆用最小二乘法進行線性回歸。直線回歸方程的相關系數應不低于0.98。
　�、隍炞C結果  以效價理論值的對數（橫坐標）對其相應的效價測定值的對數（縱坐標）作圖，采用最小二乘法進行線性回歸，結果如圖1所示。擬合的直線回歸方程為y=1.0182x+0.0385，相關系數為0.987。
　　

　�。�4）范圍
　�、倏山邮軜藴�  報告相對準確度、中間精密度和線性符合要求時的效價水平范圍，該范圍應至少涵蓋相對效價的質量標準范圍（80%～150%）。
　�、隍炞C結果  本法中相對準確度、中間精密度和線性均符合要求的效價水平范圍為64%～156%，涵蓋了其質量標準范圍。
　�。ǘ�）體內生物學活性測定法
　　1. 實驗設計及測定結果
　　以卵泡刺激素生物測定法（通則1216）的驗證為例，考察測定方法的相對準確度、中間精密度、線性和范圍，四項指標的驗證釆用合并設計。取尿促性素國家標準品，用制備的溶劑配成每1ml中分別含5.6IU的標準品溶液高劑量組及4.48IU、5.6IU和7IU的待測溶液高劑量組，然后釆用高劑量組溶液依次制備中劑量組和低劑量組溶液，相鄰劑量組的濃度比值為1：0.5，按通則1216進行試驗。即3個待測溶液高劑量組的相對效價水平分別為80%、100%和125%，在對數尺度上呈均勻間隔。每個效價水平在不同日期獨立測定3次，測定結果見表4。
　　

　　2. 可接受標準及驗證結果
　�。�1）相對準確度
　�、倏山邮軜藴�  每個效價水平相對效價測定值的相對偏倚應在±20%范圍內。
　�、隍炞C結果  按“（二）各驗證指標的驗證策略2.相對準確度（2）評價方法”項下計算每個效價水平相對效價測定值的相對偏倚，結果見表5。相對偏倚均在±20%范圍內。
　　

　�。�2）中間精密度
　�、倏山邮軜藴�  每個效價水平相對效價測定值的幾何變異系數（GCV，%）應不大于20%。
　�、隍炞C結果  按“（二）各驗證指標的驗證策略3.精密度（2）評價方法”計算每個效價水平相對效價測定值的幾何標準偏差和幾何變異系數，結果見表6。每個效價水平測定值的幾何變異系數均小于20%。
　　

　�。�3）線性

　�、倏山邮軜藴�  以效價理論值的對數（橫坐標）對其相應的效價測定值的對數（縱坐標）作圖，釆用最小二乘法進行線性回歸。采用F檢驗進行直線回歸方程的顯著性檢驗，應具有統計學意義。
　�、隍炞C結果  以效價理論值的對數（橫坐標）對其相應的效價測定值的對數（縱坐標）作圖，采用最小二乘法進行線性回歸，結果如圖2所示。擬合的直線回歸方程為y=0.6264x+0.0085，相關系數為0.84，采用F檢驗進行回歸方程的顯著性檢驗，直線呈顯著回歸（P=0.004）。
　�。�4） 范圍
　�、倏山邮軜藴�  報告相對準確度、中間精密度和線性符合要求時的效價水平范圍，該范圍應至少涵蓋相對效價的質量標準范圍（80%～125%）。
　�、隍炞C結果  本法中相對準確度、中間精密度和線性均符合要求的效價水平范圍為80%～125%，涵蓋了其質量標準范圍。
　　

　　三、統計學術語及名詞解釋
　　1. 系統適用性(System Suitability)指判斷試驗結果有效性的要求，考察試驗體系是否能夠按照試驗方案的規定良好運行。
　　2. 樣品適用性(Sample Suitability)指判斷樣品結果有效性的要求，主要通過供試品和標準品劑量-反應曲線的相似性來評價。
　　3. 等效性檢驗(Equivalence Test)系一種通過比較兩個量值的差異是否在允許的區間范圍內來判斷兩個量值是否等效的統計學方法。
　　4. 對數正態分布(Lognormal Distribution)指一個隨機變量的對數服從正態分布，則該隨機變量服從正態分布。
　　5. 相似性(Algebraic Similarity)指在供試品和標準品具有同質性的前提下，供試品和標準品的劑量-反應曲線在某種程度上呈代數相關，一般表現為劑量-反應曲線平行。
　　6. 置信區間(Confidence Interval，CD)指在給定的置信水平下，由統計學方法計算出的包含參數真值的隨機區間。
　　7. 對數平均值(Logmean Value)指將隨機變量取對數后求其平均值所得的值。
　　8. 對數標準偏差(Logstandard Deviation)指將隨機變量取對數后求其標準差所得的值。
　　9. 方差分析法(Analysis of Variance，ANOVA)指通過分析研究不同來源的變異對總變異的貢獻大小，從而確定各種因素對實驗結果影響的大小的統計方法。
　　10. 統計過程控制(Statistical Process Control，SPC)指用于監控過程中的漂移或變化趨勢的一套統計學方法。